差示掃描熒光法 （DSF，內在熒光法）是一種經濟高效且易于使用的非標記生物物理技術，其原理是通過測量溫度升高時熒光發射的相應變化來確定蛋白質的熱變性轉變溫度（所謂的熔解溫度，T_m值）。

新一代高通量差示掃描熒光儀 SUPR-DSF 利用內在熒光 (IF)技術，依賴于色氨酸固有熒光發射光譜波長的變化。SUPR-DSF 使用行業標準的 384 微孔板，在幾小時內，而不是幾天和幾周，就可以對數千個樣品的穩定性進行測量和比較。SUPR-DSF 結合了低樣品用量和高通量兩個優勢，解決了傳統技術所遇到的挑戰。

圖2內在熒光 DSF 原理：依賴于色氨酸固有熒光發射光譜的變化

在生物藥物早期發現中可以使用 SUPR-DSF 進行突變體的比較和篩選，本例對 16 個樣品進行比較，其中包括 1 個野生型蛋白（WT）和 15 個單點突變體。

準備終濃度為 0.2 mg/mL的樣品，以每孔 20 μL 的體積將其加入384微孔板，每個樣品做三次重復，在微孔板上放置透光膜以防止蒸發。微孔板以 1°C/min 的速率進行掃描，掃描溫度范圍為 20°C - 100°C。使用標準方程對數據進行擬合，然后通過熔解溫度 T_m 對穩定性進行排序。

SUPR-DSF 生成了16個樣品的高質量熔解曲線，并且，計算出的三次重復數據的熔解溫度差異小于 0.2°C。如圖3所示，與野生型WT（藍色）相比，其中3個突變體（9、13和14）的熔解曲線左移，說明其蛋白穩定性降低；其余12個突變體的穩定性均有所提高，突變體1、8和12的穩定性提高最大。

圖3 15個突變體（橙色）與野生型（藍色）的熔解曲線對比

圖4展示了幾個代表性樣品的熔解曲線，可以發現一些蛋白質發生了單一熱轉變（WT蛋白與突變體7和8），而另一些蛋白質（突變體1和14）則清楚地顯示出兩次熱轉變，熔解曲線上有兩個拐點。此外，包括突變體1在內的幾個突變體在第一次熱轉變時具有與突變體8非常相似的熔解曲線，但隨后在更高的溫度下進行了第二次熱轉變。

突變蛋白質從單一熱轉變到兩次熱轉變的變性能力表明，進一步的修飾應該關注于蛋白質中較不穩定的區域。通過 SUPR-DSF 提供的數據，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進行深入研究。

圖4 代表性樣品的熔解曲線

上述實驗中SUPR-DSF在1.5小時內產生了48個樣品（16個突變體，3次重復）的高質量熔解曲線，但很容易擴展到384個樣品（一塊384孔板），在同樣的掃描條件下完成384個樣品的測試也僅需1.5小時。

結論 Conclusion

通過上述實驗可以看出SUPR-DSF與目前穩定性研究的其他技術相比，具有非常顯著的高通量優勢。SUPR-DSF不僅記錄了熔解溫度 T_m，還可以給出：去折疊的起始溫度 T_onset和范特霍夫焓變ΔH_vH，從而更深入地了解樣品之間的差異。

綜上所述，新一代 SUPR-DSF具有高靈敏度、高通量和耗材通用性好等優勢，使用10-20 μL樣品在90分鐘內即可給出384個樣品的T_m、T_onset和ΔH_vH等信息，確定不同樣品之間的微小差異，避免候選藥物的下游失敗，從而大大節省了生物治療藥物發現過程中的時間和成本。