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納米藥物載體 · 熱點應用
本文由馬爾文帕納科GPC應用專家馮慧慶供稿
聚合物納米藥物載體
納米藥物載體可實現靶向藥物治療。靶向給藥治療是指供助載體、配體或抗體將藥物通過局部給藥或全身血液循環而選擇性地定位于靶組織、靶器官、靶細胞或細胞內結構的給藥系統。在特定的導向機制作用下，納米藥物載體輸送藥物到特定靶點，發揮治療作用，可達到藥劑用量少、毒副作用低、藥效持續、生物利用度高、長時間保持靶目標的有效藥物濃度的效果。
常見的納米藥物運載體系
在藥學研究中，正確定位小分子藥物的給藥位置和控制藥物釋放曲線是一個關鍵的挑戰。通過小分子藥物與聚合物納米載體偶聯起來，在很大程度上實現細胞內精準靶向給藥，在實際應用過程中有較好的效果。該方法既可用于控制藥物釋放曲線，又可用于控制藥物釋放位置，以最大限度地減少可能的副作用。
阿霉素（Doxorubicin）
阿霉素(Dox)是一種高效抗腫瘤抗生素，對肺癌、急慢性白血病等多種惡性腫瘤都有很強的細胞毒性，其機制是：通過將自身插入細胞的DNA堿基對中，破壞DNA的雙螺旋結構，阻斷DNA復制和RNA轉錄。通常是通過血液循環導入腫瘤細胞實現其抗腫瘤功能。
聚谷氨酸(PG)是一種以氨基酸谷氨酸為基礎的具有生物相容性的聚合物。試驗結果表明Dox和PG的偶聯，可以實現靶向給藥，提高藥物在靶體內的聚集度，延長體內循環時間，降低毒副作用。
在本文中我們展示了馬爾文帕納科OMNISEC多檢測器SEC如何對PG、Dox 和兩個PG-Dox 偶聯樣品進行表征。這種先進的分析技術可用于研究藥物加載效率和藥物加載后發生的聚合物結構變化。
研究方法
PG和PG-Dox偶聯物溶解在在pH7.4的PBS緩沖液中，通過OMINISEC進行樣品的分離和檢測。OMNISEC是一個多檢測器SEC系統，包括示差檢測器(RI)、紫外檢測器(UV)、光散射檢測器(LS)和粘度檢測器(IV)。流動相為PBS pH 7.4，含30%(v/v)甲醇水溶液；采用馬爾文A6000M和A3000色譜柱分離。
OMNISEC多檢測器SEC
檢測結果與討論
測試PG樣品和兩個PG-Dox偶聯物樣品色譜圖如圖1所示，PG的數值結果見表1。PG樣品分離顯示一個單峰，測得其平均分子量(MW)約為13KDa。再看兩個偶聯樣品，都分離出和PG具有相似保留體積的多峰。較早洗脫的光散射色譜圖(綠色，12-14mL)表明存在一些大的聚集體。而且，這些峰包含明顯的紫外吸收信號，表明Dox的存在成功地偶聯到聚合物上。
圖1 PG（A）、PG-Dox 1（B）和PG-Dox 2（C）多檢測器色譜圖
表1 PG測試結果
在圖2 A中可以看到，在不同進樣量下檢測游離Dox的UV色譜圖，可以看到游離的Dox從柱上洗脫得很晚，實際上已經在整個柱體積之后。這清楚地表明了Dox與色譜柱發生了顯著的相互作用，延遲了Dox的洗脫。但從圖2 B所示濃度響應曲線可以看出，盡管存在相互作用，回收率仍然接近100%。該校準曲線用來測量存在于PG-Dox樣品中的Dox的量。
圖2 A：不同進樣量Dox在UV（490nm）色譜圖；B：Dox濃度校準曲線
如果我們確定36mL處的峰為游離Dox，這樣PG-Dox樣品中的相同位置峰也能確定為游離Dox。如圖3所示，可以清楚地確定偶聯樣品含有PG-Dox偶聯物和游離Dox。
圖3 UV色譜圖顯示偶聯樣品含有PG-Dox偶聯物和游離Dox
使用圖2 B中的濃度校準曲線，可以計算偶聯樣品中存在的Dox量。如表2所示，兩種PG-Dox偶聯物都含有游離的Dox。在一次注射體積中，PG-Dox 1的偶聯物中含有大約11μg的Dox，而PG-Dox 2的偶聯物中含有大約39μg的Dox。然后，可以計算出樣品中注入的總Dox質量和Dox濃度。然后，可以根據溶解物質的質量計算出近似的總樣品濃度。這樣就可以計算每個PG-Dox偶聯物中Dox的近似負載量。由此可以近似地看出，樣品2的偶聯物中含有的Dox是樣品1的三倍。
表2 計算兩個偶聯樣品中Dox的負載量
我們可以對PG-Dox偶聯物進一步表征（其中dn/dc假設分析），計算偶聯聚合物的近似分子量、特性粘度和結構數據，如表3所示。
表3 PG-Dox偶聯物測試結果
Mark-Houwink(M-H圖)顯示了特性粘度作為分子量的函數，是分子間結構差異的直觀表示。在溶液中密度較高的聚合物在M-H圖上看起來較低，用來研究結構變化，如支化、偶聯等結構變化。圖4顯示了3個樣本的M-H圖。首先，這兩個PG-Dox偶聯物M-H曲線顯著低于單獨的PG。這是我們預料中的，因為藥物分子的偶聯將增加聚合物在溶液中的表觀密度，并且具有更大Dox負載量的樣品將進一步向下移動。PG-Dox 1和PG-Dox 2之間的斜率不同，說明Dox負載量可能不是隨分子量均勻分布的。
圖 4 Mark-Houwink曲線圖疊加顯示PG和PG-Dox偶聯物
結論
本文展示了如何將多檢測器SEC用于高分子聚合物偶聯小分子藥物傳遞表征分析的方法。在相同的測試條件下，對原聚合物、游離藥物(Dox)和兩種偶聯產物進行了表征。藥物的紫外吸光度使得可以測量負載水平和評估兩種偶聯物的偶聯水平。通過假設分析，偶聯分子量和結構也可以測量并相互比較。
小分子藥物的輸送在實際應用中面臨許多挑戰，與較大的聚合物偶聯是提高藥物定位和載藥量的一種策略，但要獲得可靠和可重復的結果，需要先進的表征方法。通過使用OMNISEC這樣的多檢測器系統進行分析，研究人員可以更好地表征和研究，從而控制附著在聚合物納米輸送載體上的藥物量以及產品的分子量和結構，以實現最佳的藥物輸送效率。
關于馬爾文帕納科
馬爾文帕納科的使命是通過對材料進行化學、物性和結構分析，打造出更好的客戶導向型創新解決方案和服務，從而提高效率和產生可觀的經濟效益。通過利用包括人工智能和預測分析在內的最近技術發展，我們能夠逐步實現這一目標。這將讓各個行業和組織的科學家和工程師可解決一系列難題，如盡可能地提高生產率、開發更高質量的產品，并縮短產品上市時間。
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